General Clayton Abernathy / Hawk (Dennis Quaid) – Membro G.I.Joe – O destemido líder da equipa de elite mais perigosa do exercito norte-americano. Um homem abastado e intelectual que desempenha o papel de líder sem grandes problemas de confiança ou autoridade.
Conrad Hauser / Duke (Channing Tatum) – Membro G.I.Joe – O principal soldado de campo da equipa e o segundo na hierarquia de comando. Um talentoso militar que é assombrado pelo seu conturbado passado.
Shana M. O'Hara / Scarlett (Rachel Nichols) – Membro G.I.Joe – O membro mais inteligente da equipa e é por isso que é a oficial responsável pelos departamentos mais intelectuais. A sua extrema beleza afecta alguns dos seus companheiros que não conseguem interagir convenientemente com ela.
Snake Eyes (Ray Park) – Membro G.I.Joe – Um ninja especialista em artes marciais que representa uma valorosa ajuda militar para a equipa. É dotado de uma personalidade calma e misteriosa, algo que é exacerbado pelo seu voto de silêncio.
James McCullen / Destro (Christopher Eccleston) – Membro Cobra – A mente criativa por detrás do Military Armament Research Syndicate (MARS) que depois de perceber as suas potencialidades intelectuais decide lutar contra o sistema governativo que outrora defendeu. É um perito em armas altamente destrutivas e sistemas de defesa altamente avanços.
Ana Lewis / Anastacia DeCobray / The Baroness (Sienna Miller) – Membro Cobra – Depois de ter sido publicamente humilhada pelo seu antigo noivo, Duke, Ana abandona a sociedade e dedica-se ao mundo do crime, tendo-se juntado à Cobra, onde desempenha as funções de espiã.
Thomas Arashikage / Storm Shadow (Lee Byung-Hun) – Membro Cobra – Um talentoso ninja que se assume como o principal rival de Snake Eyes. Outrora amigos próximos e acérrimos membros do clã Arashikage, Snake Eyes e Storm Shadow, lutam agora em equipas opostas com o objectivo de se tornarem nos melhores ninjas de sempre.
Rex Lewis / The Doctor / Cobra Commander (Joseph Gordon-Levitt) – Membro Cobra – Um antigo soldado profissional das forças especiais norte-americanas que desapareceu durante uma missão, tendo sido considerado morto pelos seus oficiais superior. A verdade é que sobreviveu à missão e abandonou o exército de livre vontade, tornando-se no principal cientista da Cobra. É irmão da Baroness.
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